バイオサイエンス用機器
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製品名称/型番 LIFA-FLIM
メーカー名 Lambert Instruments社
類別/応用 その他/LIFA装置
説明 LIFAはイメージの取得及び蛍光寿命イメージの生成を数秒間で行うことができます。このシステムは現在市販されているほとんどの蛍光顕微鏡に簡単に取り付けて使うことができます。
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LIFA:Lambert Instruments Fluorescence lifetime imaging Attachment

LIFAはイメージの取得及び蛍光寿命イメージの生成を数秒間で行うことができます。このシステムは現在市販されているほとんどの蛍光顕微鏡に簡単に取り付けて使うことができます。

ライフタイム・イメージとは

LIFAは固定試料及び生きた試料を計測可能です。例えばタンパク質分子間の相互作用や細胞内pH分析ができます。蛍光プローブは物理学的に確かな特性があり、励起・放射カーブが明らかです。蛍光プローブは量的蛍光顕微法において分子のローカル濃度の情報を得るのに使用されます。蛍光プローブのもうひとつの大きな特性は蛍光寿命についてです。これは励起後の放射の残光時間で通常ナノ秒オーダーです。強度レベルを使用した蛍光顕微法は特定シグナル伝達経路における高分子相互作用を観察することができます。蛍光寿命画像顕微法(FLIM:Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy)によってこれらの相互作用は調べることができます。

この場合FLIMはラベルされた特性の高分子の単蛍光プローブ(例:CFP)から他(例:YFP)へのFRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)を検出するために使います。

ドナー(例:CFP)の蛍光寿命の減少は上の蛍光寿命画像でも見られるように、局所的なFRETの発生を意味します。

FLIMには多くの応用があります。それは自動蛍光材料を含む異なる染色剤を使っても同じような吸収及び発光特性のように見えるによる蛍光の異なる寿命を区別することができます。さらに、蛍光寿命は発光強度に依存しませんのでブリーチング(蛍光の永久破壊)は蛍光寿命に影響しません。それは特定のイオン(カルシウム、pH)の局所濃度が影響される可能性があります。そしてそれは蛍光プローブの微細環境を識別することができます。FLIMはプローブの空間分布及び寿命をマージして濃度計測の信頼度を高めます。

どのように動作するのか?LIFAの特徴は?

他社のタイムドメイン法を用いる他のシステムと異なり、LIFAは周波数ドメイン法を使用しています。この方法は変調された光源とディテクタが必要です。励起光は正弦波上に変調されています。蛍光強度は放射光と励起光の振幅に対応してディレイまたは位相シフトします。位相シフトと変調振幅は蛍光試料の減衰定数(寿命)と変調周波数に依存します。

蛍光発光の位相シフトと変調振幅の検出にはイメージインテンシファイアとカメラが使われています。イメージインテンシファイアの感度は励起光の変調周波数と同じ変調されていますが位相シフトさせることが可能です。

出力シグナルレベルは位相シフトした蛍光発光シグナルに同調されたイメージインテンシファイアの感度に依存します。複数の連続する位相シフトから測定が行われます。各ピクセルの正弦カーブは測定シグナルの位相シフトに沿った正弦カーブになります。変調振幅と位相シフトの正弦カーブから蛍光発光の減衰定数がわかります。

蛍光寿命画像の作成は各ピクセルで計算された減衰時間をグレースケールまたはプセウドカラーで表示します。

どのように動作するのか?LIFAの特徴は?

検出器にはイメージインテンシファイアとCCDが組み合わされたICCDカメラが使われています。イメージインテンシファイアのゲインは変調可能です 。

カメラとイメージインテンシファイアはコンピュータで制御されます。励起光源として顕微鏡の標準アークランプハウスに取り付け可能な変調されたLEDを使用します。また、励起光源としてレーザーダイオードを使用することもできます。この場合、CWレーザーの変調を操作するためのモジュレータ用出力信号の出力も可能です。

イメージインテンシファイアとLEDの変調はFLIMシグナルジェネレータにより行なわれます。励起光源およびイメージインテンシファイアの周波数と増幅率の信号の位相シフトはコンピュータによって制御されます。

LI-FLIMソフトウェアはカメラ、イメージインテンシファイア、光源、シグナルジェネレータこれら全てのコントロールおよび 各ピクセルの蛍光寿命の計算結果を1Dまたは2Dで表示します。

蛍光寿命画像を得るために撮影された画像の各ピクセルの強度、位相、変調の値を画面上で表示できます。各ピクセルの寿命はマウスをポインティングするとステータスバーに表示されます。

主な仕様

システム仕様   システム構成
ライフタイムレンジ 0-300 ns (選択レンジによる)  
ライフタイム分解能 80 ps 変調イメージインテンシファイアをファイバカップリングしたデジタルCCDカメラ
変調周波数 最大100 MHz
計測時間 s(公称)  
スピード 12 ライフタイムイメージ/s  
空間分解能 36 lp/mm, 23 lp/mm (変調中) 1. ランプハウスにマウントした変調LED光源
デジタル出力 12 bit FLIM シグナルジェネレータ / コントロールユニット / 電源
ICCDカメラ感度 10-5 lx (@ビデオスピード)
カメラCCD画素数 1392(H) x 1040(V) 1. USB2.0インタフェイス×2
2. LI-FLIMソフトウェアパッケージ
ビニング 2 x 2, 3 x 3, 4 x 4
カメラ視野 14,4 x 10,8 mm 1. PC
2. 液晶モニタ×2
Cameraマウント Cマウント
LED波長 448nm, 468nm, 488nm, 538nm,  
  630nm, その他 オプション
検出波長域 200-900nm コンフォーカルLIFA(スピニングディスク
カメラヘッド寸法 133(L) x 116(W) x 80(H) mm TIRF-LIFA(レーザーTIRF、ホワイトTIRF)
電源/コントロールユニット寸法 47(W) x 42(D) x 20(H) cm  

システム・セットアップ

検出器にはイメージインテンシファイアとCCDが組み合わされたICCDカメラが使われています。イメージインテンシファイアのゲインは変調可能です。

カメラとイメージインテンシファイアはコンピュータで制御されます。励起光源として顕微鏡の標準アークランプハウスに取り付け可能な変調されたLEDを使用します。また、励起光源としてレーザーダイオードを使用することもできます。この場合、CWレーザーの変調を操作するためのモジュレータ用出力信号の出力も可能です。

イメージインテンシファイアとLEDの変調はFLIMシグナルジェネレータにより行なわれます。励起光源およびイメージインテンシファイアの周波数と増幅率の信号の位相シフトはコンピュータによって制御されます。

LI-FLIMソフトウェアはカメラ、イメージインテンシファイア、光源、シグナルジェネレータこれら全てのコントロールおよび 各ピクセルの蛍光寿命の計算結果を1Dまたは2Dで表示します。

蛍光寿命画像を得るために撮影された画像の各ピクセルの強度、位相、変調の値を画面上で表示できます。各ピクセルの寿命はマウスをポインティングするとステータスバーに表示されます。

応用例

FLIMによる中心体(微小管形成中心)の FRET計測。 パラホルムアルデヒド固定された異なる2種類のたんぱく質からなるドナーAlexa488とアクセプターAlexa568で標識されたHeLaとH4細胞 (neuron-like)。 FRETが示すとおり、2つのたんぱく質の中心体で相互作用が起きている。FRETによりドナーの寿命(黄色)はFRETのない場合(赤)に比べて短くなっている。(写真提供:Diaspro, LAMBS, Italy)
FLIM によるcytosol のFRET計測 一時的にpCFP とトランスフェクションされた細胞 (FRETなし,上の細胞l)とpCFP-YFP タンデム構造(FRETあり、下の2つの細胞)。FRETありのドナーCFPの寿命(青は1.9ns)はFRETなし(赤は 2.4ns)のものよりも短いことが分かる。
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